医院李宁陈澍张文宏
病历摘要
患者，男性，31岁，因“发热、盗汗4个月余，伴头痛、呕吐1个月余”入院。
现病史
患者于年1月出现低热、盗汗，体温常于午后升高，不伴有头痛、恶心、呕吐，未予系统诊治。3月17日自测体温38℃，并出现头痛、恶心、非喷射性呕吐，无畏寒、寒战等症状，自服退热药体温可降至正常，但随后体温反复升高，多于午后发热，体温波动于37.5~38.5℃，头痛逐渐加重，之医院，行脑脊液检查示：压力mmH2O，白细胞×/L，多核36.2%，蛋白1.1g/L，糖1.8mmol/L，氯mmol/L，脑脊液隐球菌涂片阴性，腺苷脱氨酶（ADA）正常范围内，血结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）阳性（B孔），拟诊为“结核性脑膜炎”，予异烟肼+利福平+吡嗪酰胺+乙胺丁醇+莫西沙星+阿米卡星+对氨基水杨酸（PAS）抗结核及降颅压等对症治疗。
之后患者发热、头痛症状及脑脊液检测均无明显改善，于4月2日行头颅磁共振成像（MRI）示“脑实质内多发异常信号，脑膜多发异常强化”，仍诊为“结核性脑膜炎”，继续上述抗结核方案，加用地塞米松5~10mgqd减轻炎性反应。2周后复查脑脊液细胞数无明显改变，以多核为主，蛋白1.4g/L，糖0.6mmol/L，患者仍有头痛和发热，最高体温39℃。在原有7联抗结核方案基础上，先后加用头孢曲松、氟康唑治疗。4月20日，患者出现烦躁、意识模糊，4月21日留置腰大池引流，并予丙硫异烟胺替换乙胺丁醇继续7联抗结核方案基础上，加用利奈唑胺mgbid，患者意识逐渐转清。4月28日拔除腰大池引流管，后因患者头痛加重于4月29日再次置入腰大池引流管。期间多次复查脑脊液白细胞波动于~×/L，以多核为主，蛋白1.5~1.6g/L，糖1.0~1.8mmol/L，其中2次留取脑脊液培养提示曲霉生长，曾短期使用两性霉素B治疗1周。5月7日转至我院治疗。
既往史及个人史
医院临床医生，有结核接触史。年患淋巴结核（淋巴结病理证实），行抗结核治疗（HREZ）2个月，自觉好转后停药；年5月因患“肺结核并咯血”住院治疗，出院后继续HREZ方案抗结核治疗9个月后停药。否认手术外伤史及药物过敏史。
入院体格检查
体温37.6℃，脉搏70次/分，呼吸20次/分，血压/79mmHg。神志清，精神萎，消瘦。皮肤巩膜无黄染，锁骨上浅表淋巴结未及肿大。头颅无畸形，右侧瞳孔约3.5mm，左侧约2.5mm，对光反射存在，颈稍有抵抗。两肺呼吸音清晰，未闻及明显的干湿音。心律齐，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。腹平软，无压痛及反跳痛。四肢肌张力略高，双下肢无水肿。双侧巴氏征阳性，余神经系统检查无异常。
诊疗经过
问题1诊断结核性脑膜炎正确吗？为什么抗结核治疗效果差？
本患者有结核接触史，既往患淋巴结结核、肺结核，此次发热、头痛起病，查体有颈抵抗，多次腰穿脑脊液检查，颅压增高，脑脊液细胞数增多，糖及氯化物均低，蛋白含量高（表1），T-SPOT.TB阳性，临床上符合结核性脑膜炎常见表现。
表1入院后脑脊液观察表（5月13日及以前为腰大池引流数据，5月15日及以后为脑室外引流数据）
考虑患者平日工作中频繁接触结核病患者，且自身有两次结核感染史，抗结核治疗并不规范，要想到本次疾病是否有耐药结核菌感染的可能。
患者医院经过系统7联抗结核方案治疗6周，临床症状及脑脊液检查仍无改善，尚须考虑有无其他混杂因素，是否存在由其他病原体导致的多重感染？
患者于5月7日入我院后，留取脑脊液行病原学检查，并考虑入院前（5月2日）脑脊液白细胞×/L，不能排除细菌感染可能，予利奈唑胺联合美罗培南抗感染治疗，应用利奈唑胺是基于兼顾细菌和结核感染的考虑。
治疗3天，患者发热、头痛无明显改善。此时，腰大池引流液培养提示丝状真菌生长，医院3次脑脊液培养曲霉菌阳性，抗结核治疗已达6周余，糖含量仍明显降低，故真菌性脑膜炎不能除外，5月9日起加用伏立康唑抗真菌治疗。此时外周血CD4+T细胞绝对数降至51/mm3。患者属免疫力极其低下人群。而再次脑脊液培养仍见丝状真菌生长，经扩增ITS基因检测鉴定，所培养的真菌为粗球孢子菌（图1）。
图1脑脊液培养出真菌生长及真菌序列
问题2除了基因测序外，粗球孢子菌感染还有哪些检测手段？
除了基因测序外，粗球孢子菌感染的检测手段还包括：①直接镜检，见到内有孢子的孢子囊，真菌培养见菌丝、关节孢子；②球孢子菌素皮肤试验阳性，主要用于流行病学调查；③血清学检查，IgM为急性感染的指标，IgG血清滴度≥1:4表明存在现感染或新近感染，更高滴度（≥1:32）表示可能已经发生肺外感染；④脑脊液抗体阳性，为球孢子菌脑膜炎特异性检测；⑤病理，原发性皮肤球孢子茵病为慢性肉芽肿，内有嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞浸润，有时可见小脓疡，内含有内孢子的孢子囊；进行性播散球孢子菌病则有脓疡形成，可见酪样坏死，在异型巨细胞内可见内孢子囊。
患者外周血CD4+T细胞绝对数低至51/mm3，属免疫极度低下患者，又患有结核性脑膜炎，血脑屏障不完整。在这两大因素基础上，重叠粗球孢子菌感染，导致真菌合并结核性脑膜炎。
治疗方面，根据粗球孢子菌的特性及药敏结果，加用氟康唑抗真菌治疗，患者体温一度下降，精神状态好转。5月22日，患者出现尿失禁，加强脑脊液引流后好转。5月26日又出现嗜睡、高热，双侧瞳孔不等大，右侧约4mm，左侧2.5mm，对光反射迟钝。行床边胸片提示粟粒性肺结核。且Ommaya置管处引流液浑浊，革兰染色涂片提示为阳性球菌，随后培养结果为MRCNS+MRSA，考虑本次革兰阳性球菌感染是在患者免疫力极度低下的基础上，发生了导管相关性感染，属院内感染而非首发感染，但明显导致了病情急剧恶化。
虽经积极抗感染、抗真菌、抗结核治疗，患者终因严重混合性中枢神经系统感染、粟粒性肺结核、T细胞免疫功能缺陷，治疗无效死亡。
问题3粟粒性肺结节影与CD4+T细胞计数在疾病发生发展中处于何种地位？
本例患者初入我院时查CD4+T细胞绝对计数为/mm3，当时床边胸片仅报两肺纹理增多（图2）。肺部CT提示：左下肺胸膜下小结节，双侧少量胸腔积液。
图25月7日床边胸片；图36月7日床边胸片
至5月17日，患者CD4+T细胞绝对数仅为51/mm3。6月7日复查胸片，发现两肺纹理增多，双肺可见粟粒结节影（图3）。
患者双肺出现泛发型粟粒样结节影，考虑有2种可能性。
⑴粟粒性肺结核。影像学表现为：发病初期，X线胸片不易显示；2周左右胸片上可见纹理增多、增强，形成网状阴影，当病变侵入肺泡腔，则表现为肺野透光度降低，呈磨玻璃状，肺纹理模糊不清；发病6周后胸片上可见双肺弥漫分布的1～3mm大小微结节。结合这些特点，不难想到患者是否开始就有血行播散性肺结核，只是影像学尚未表现出来，因血行播散导致中枢感染，又因细胞免疫低下，而合并真菌、细菌混合感染。
⑵播散性球孢子菌病的肺部表现。患者CD4+T细胞绝对数仅为51/mm3，属免疫力极度低下患者，且为亚裔人群，均为播散性疾病的高危因素。播散性疾病暴发型患者常表现为发热、盗汗、消瘦、肺部出现泛发型粟粒样改变，有时与粟粒性肺结核确实难以鉴别。
翁心华教授点评
粗球孢子菌属双相型。组织内呈圆形、厚壁，在室温或自然界则形成丝状分隔菌丝体。人吸入或接触带关节孢子的土壤或灰尘可引起原发性肺或皮肤感染。粗球孢子菌感染常见于免疫力下降或免疫抑制人群，多呈播散性感染，病死率高达50%。播散性球孢子菌病表现为发热、盗汗、呼吸困难、消瘦，肺部泛发型粟粒样改变，病情迅速恶化而死亡。30%~50%累及脑。播散性球孢子菌病需要氟康唑和两性霉素B长疗程、足剂量治疗。
球孢子菌病在美国西南部、墨西哥和中南美部分地区呈地方性流行。欧、亚和非洲也有个案报道，日本报道的原发性肺球孢子菌病均为流行地归国人员，在我国同样罕见。
本例患者外周血CD4+T细胞绝对数低至51/mm3，属于细胞免疫极度低下的结核性脑膜炎患者，多次脑脊液培养见丝状真菌生长，我们以ITS2区域为测序靶点进行扩增DNA，经测序鉴定，感染的真菌为粗球孢子菌。
以往，我们常通过表型的方法寻找和鉴定病原体，存在阳性率低、鉴定困难的不足之处。分子生物学技术的快速发展给病原体鉴定带来了巨大的进步。16srRNA作为细菌的检测码和ITS片段作为真菌鉴定的“条形码”是近来常用的分子技术鉴定手段，有着快速、准确和高敏感性。这使得我们能够在一些按传统方法诊治疗效欠佳的患者，特别是免疫低下的患者中发现多重病原体，让我们能够选择有效的治疗方案来覆盖它。当然，分子诊断技术的高敏感特性提醒我们，在治疗中要密切监测疗效，以警惕假阳性的可能。
小贴士
1、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)
粗球孢子菌属双相型。在组织内呈圆形、厚壁、直径20~80μm，成熟时含有圆形或不规则形内生孢子，数目数个到数百个，呈周边向内排列，球体成熟后又释放出内生孢子，形成新球体（图4）。
图4组织内粗球孢子菌
在室温或自然界，粗球孢子菌则形成丝状分隔菌丝体，产生关节孢子，即关节菌丝型（图5）。孢子型和关节菌丝型在一定条件下可互相转化。关节孢子具高度传染性。
图5关节菌丝型粗球孢子菌示意图
在流行地区，粗球孢子菌发育生出关节孢子，人吸入或接触带关节孢子的土壤或灰尘，通过呼吸道或皮肤引起原发性肺或皮肤感染。
2、应用分子生物学方法鉴定真菌菌种
分子生物学技术的快速发展给病原真菌鉴定带来了巨大的进步，分子鉴定已成为该领域的重要研究方向。
以基因序列为鉴定基础的分子生物学方法对具有种间差异性和种内保守性的目标区域进行聚合酶链反应（PCR）扩增，随后进行序列测定，并在数据库中比对得到鉴定结果，这种测序的方法由于具有客观、重复性好等优点，目前在病原真菌的鉴定中常被认为是分子鉴定的“金标准”。
近年来，更多学者正致力于应用“DNA条形码（DNABarcoding）”技术对真菌进行分子鉴定，并努力使之标准化，即利用一个通用引物可扩增的片段，通过对其进行序列测定和比对，完成对所有真菌的鉴定和分类，最新的研究倾向于将ITS片段作为真菌鉴定的“条形码”。瑞士学者戴安娜（DianaE）等，在年至年间收集到的株真菌菌株中进行验证，结果显示，针对ITS序列扩增，进行序列测序及比对是获得未知真菌种属信息的一种可靠方法。ITS片段包括18s和5.8s亚基rDNA间的ITS1以及5.8s和28s亚基rDNA间的ITS2，是最常用于真菌分子鉴定的测序靶点。对于本例患者，我们以ITS2区域为测序靶点进行扩增DNA，经测序鉴定，感染的真菌为粗球孢子菌。
3、粗球孢子菌病
球孢子菌病（CM），是一种由粗球孢子菌引起的一种局限或播散性疾病，是一种地方性流行病，在美国西南部、墨西哥和中南美部分地区呈地方性流行。欧、亚和非洲也有个案报道，在我国极少发现。临床上分为如下几种。
⑴原发性肺球孢子菌病：60%患者无症状，40%多表现为流感样症状。重症者可有发热、胸痛、咳嗽、无力。典型胸片表现为在肺中下叶有2~3cm大小结节，痊愈后留下钙化点。
⑵皮肤球孢子菌病：比较少见，通常为意外接触感染本菌孢子后，接触处产生下疳样结节性损害，可能有局部淋巴结炎，但无内脏病变。
⑶慢性肺球孢子菌病：5%原发性肺球孢子菌病发展为慢性，临床表现似肺结核。严重的肺型疾病的危险因素包括糖尿病、吸烟和高龄。
⑷播散性球孢子菌病：多见于免疫抑制患者，病死率为50%。暴发型表现为发热、盗汗、呼吸困难、消瘦，肺部泛发型粟粒样改变，病情迅速恶化而死亡。30%~50%累及脑，表现为脑膜炎、脑积水、血管炎。40%表现为骨髓炎。其它可累及肝、脾、肾上腺、眼及前列腺等。播散型疾病的危害因素包括非洲裔和亚裔、妊娠、免疫抑制（例如艾滋病）等。
治疗方面，原发性者多不需要治疗，具有自限性。播散型者需要药物长疗程足剂量治疗，可能有效药物包括氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B和伏立康唑。
来源：中国医学论坛报
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